연구 개요

이번 연구는 마우스 달팽이관의 Lgr5 양성 전구세포(LPC)로부터 동종(homotypic) 내이 오가노이드(IEO)를 확립하고, 소닉 헤지호그(Shh) 어고니스트 처리를 통해 불완전하게 형성되던 섬모 구조(stereocilia)의 성숙을 유도하는 분자적·기능적 메커니즘을 규명하는 데 목적을 두었다. 전사체 분석(bulk RNA-seq, scRNA-seq)과 전자현미경, FM1-43 흡수 분석, 마이크로전극 어레이(MEA) 기록을 결합한 통합 분석법을 활용하여 유모세포 성숙에 관여하는 핵심 신호 경로를 도출하였다.

감각신경성 난청은 달팽이관 유모세포의 비가역적 손상에 의해 발생하며, 포유류에서 자연 재생이 이루어지지 않는다는 점에서 근본적인 치료 한계가 존재한다. 이에 따라 재생의학 분야에서는 Lgr5 양성 전구세포를 출발점으로 한 오가노이드 기반 유모세포 재생 전략이 주목받고 있으며, 본 연구는 동종 배양계에서 섬모 성숙이 이루어지지 않는 핵심 원인을 규명하고 Shh 신호를 통해 이를 극복하는 방법을 제시하였다.

연구 배경

유모세포(hair cell, HC)는 달팽이관 내에서 섬모 다발(stereocilia bundle)을 통해 기계적 자극을 전기 신호로 변환하는 기계전기변환(mechanotransduction)을 담당한다. 이 과정은 섬모 다발의 정밀한 구조적 배열, 특히 기저판(cuticular plate)에 단단히 고정된 뿌리(rootlet) 구조와 계단식(staircase) 배열에 의존한다. 한번 손상된 포유류 유모세포는 자연 상태에서 재생되지 않으므로, 이를 인위적으로 재생시키는 연구가 전 세계적으로 활발히 진행 중이다.

내이 오가노이드(inner ear organoid, IEO) 기술은 줄기세포 또는 전구세포로부터 3차원 구조를 형성하여 달팽이관 세포를 시험관 내에서 재현하는 방법이다. 특히 Lgr5 양성 전구세포(LPC)는 달팽이관 감각 상피의 지지세포 중 유모세포 재생 잠재력이 가장 높은 세포군으로 알려져 있다. 그러나 FACS나 MACS를 통해 LPC만을 순수하게 분리한 동종 배양 환경에서는 유모세포 유사 세포가 형성되더라도 섬모 다발이 온전히 발달하지 못하는 문제가 반복적으로 보고되었다. 이는 이종 세포 간 신호 교환(paracrine signaling)이 섬모 성숙에 필수적임을 시사하며, 본 연구는 그 공백을 Shh 신호 경로로 채울 수 있는지를 검증하였다.

소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog, Shh)는 발생 과정에서 다양한 기관의 형태발생을 조절하는 핵심 형태발생인자(morphogen)이다. 내이 발달 단계에서도 Shh 신호는 달팽이관의 축 방향 패턴 형성과 감각 전구세포의 운명 결정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 Shh와 상호작용하는 Fgf10이 내이 형태발생에 필수적이라는 선행 연구 결과를 근거로, 연구진은 MACS 배양계에서 Fgf10의 하향 조절이 섬모 미성숙의 원인 중 하나일 수 있다고 가설을 세우고, Shh 어고니스트인 퍼모르파민(purmorphamine)을 처리하는 실험 조건을 설계하였다.

주요 발견 1 — 동종 배양 오가노이드에서의 섬모 미성숙 문제 확인

연구진은 LPC를 수동 분리법(MI)과 자기활성화 세포 분리법(MACS)으로 각각 분리하였다. MI법으로 얻은 세포 중 Lgr5 양성 세포 비율은 13.15%에 불과하였으나, MACS법을 통해서는 96.07%의 순도로 LPC를 획득할 수 있었다. 두 방법으로 얻은 LPC는 동일한 배양 조건에서 구형체(spheroid)를 형성하였으며, 이후 Wnt 작용제(CHIR99021)와 Notch 억제제(LY411575)를 병용하는 소분자 방식으로 분화를 유도하였다.

분화 24일차(D24)에 두 군 모두에서 Myo7a 양성 유모세포가 형성되었으나, 기능적 성숙도에서 뚜렷한 차이가 나타났다. MI군 오가노이드에서는 F-액틴이 발현된 뚜렷한 섬모 다발이 형성되었으며, FM1-43 염료 흡수 검사에서도 기계전기변환 채널이 활성화되어 있음이 확인되었다. 반면, MACS 동종 배양 오가노이드에서는 섬모 다발 형성이 현저히 불완전하였고, FM1-43 흡수도 거의 관찰되지 않았다. 이를 통해 동종 배양 환경에서 생성된 유모세포 유사 세포는 기계전기변환 기능이 결여된 "미성숙" 상태에 머물러 있음을 확인하였다.

전사체 수준에서의 비교를 위해 분화 10일차(D10)에 bulk RNA-seq을 수행한 결과, MI군 대비 MACS군에서는 내이 발달 관련 주요 유전자인 Fgf10, Gata3, Tmprss3, Shox2의 발현이 유의미하게 낮았다. 이들 유전자는 모두 달팽이관 조직 형성과 유모세포 분화에 필수적인 인자들로, 그 발현 저하는 이종 세포 간의 paracrine 신호 교환이 차단됨으로써 나타난 결과로 해석된다. 특히 Wnt 신호 관련 유전자는 MACS군에서 오히려 상향 조절되어, 과도한 Wnt 활성화가 섬모 성숙을 저해할 수 있다는 가능성도 제기되었다.

주요 발견 2 — Shh 어고니스트 처리를 통한 섬모 성숙 유도

MACS 동종 배양계의 결함을 극복하기 위해 연구진은 수정된 배양 프로토콜을 설계하였다. 분화 유도 시작일(D11)부터 Shh 어고니스트인 퍼모르파민(purmorphamine, 1 µM)을 추가하였고, D18부터는 Wnt 작용제(CHIR99021)를 Wnt 억제제(IWP-2)로 교체하여 과도한 Wnt 활성화를 차단하였다. 이 조합 처리는 발달 신호의 공간·시간적 균형을 맞추려는 전략에 기반한 것이다.

D24에서의 면역형광 분석 결과, F-액틴과 Myo7a가 이중 양성인 조직화된 섬모 다발 구조가 뚜렷하게 형성되었으며, FM1-43 흡수 검사에서도 기계전기변환 활성이 확인되었다. 전자현미경(TEM) 분석에서는 섬모 다발의 평균 길이가 1.0 ± 0.28 µm로 대조군보다 유의미하게 길었고, 기저판에 섬모를 고정하는 rootlet 구조와 계단식(staircase) 배열이 명확하게 관찰되었다. 이는 Shh 처리군의 유모세포가 기능적 성숙에 한층 가까워졌음을 형태학적으로 뒷받침한다.

분자 마커 수준에서도 주목할 만한 결과가 도출되었다. 기저판 구성에 핵심적인 단백질인 Lrba, Lmo7, Pls1의 발현이 Shh 처리군에서 뚜렷하게 증가하였으며, 달팽이관 계통을 특정하는 전사인자 Gata3와 Nr2f1도 Myo7a 양성 세포에서 강하게 발현됨이 확인되었다. 또한 형광 분석에서는 전시냅스 리본 단백질 Ctbp2와 섬모 마커 Espin(Espn)의 발현이 서로 구별되는 세포 내 위치에서 동시에 확인되어, 시냅스 구조와 섬모 구조가 함께 발달하고 있음을 시사하였다.

스캐닝 전자현미경(SEM) 분석에서는 V자 모양으로 배열된 섬모 다발이 관찰되었으며, 이는 성체 달팽이관 내이 유모세포의 특징적 구조와 일치한다. 섬모 사이의 연결 구조(tip link 유사 구조)도 측면 및 상면 TEM 이미지에서 포착되었다. 일부 오가노이드에서는 1+8 미세소관 구성의 운동성 섬모(kinocilium) 유사 구조도 발견되어, 지지세포의 직접 전환분화(transdifferentiation)로 형성된 유모세포의 특성을 보여주었다.

주요 발견 3 — 전사체 분석: Shh가 달팽이관 유모세포 발달 유전자를 활성화

Bulk RNA-seq 비교 분석 결과, MACS 대조군 대비 Shh 처리군에서 755개 유전자가 상향 조절되고 55개가 하향 조절되었다. 특히 달팽이관 유모세포 관련 533개 알려진 유전자 중 19개가 Shh 처리군에서 유의미하게 증가하였으며, 이는 주로 섬모 형성 및 기저판 구조와 관련된 유전자들이었다. 4개 군(MId10, MACSd10, Shh 처리군, MACSd24)을 비교한 PCA 분석에서 Shh 처리군의 전사체 프로파일이 MI군과 가장 유사하게 나타나, Shh 처리가 이종 세포 환경의 효과를 일부 대체함을 보여주었다.

유전자 온톨로지(GO) 분석에서는 감각 기관 발달(GO:0007423), 조직 형태발생(GO:0048728), 기계수용체 분화(GO:0042490), 섬모 조직화(GO:0044782) 등의 경로가 Shh 처리군에서 유의미하게 농화(enrichment)되었다. MACS 대조군에서 억제되어 있던 Fgf10과 Nr2f1의 발현이 Shh 처리 후 모두 유의미하게 회복되었는데, 이는 Shh가 직접적으로 이들 유전자의 전사를 촉진함으로써 형태발생 신호 네트워크를 재활성화한다는 점을 시사한다.

주요 발견 4 — 어셈블로이드 전기생리학적 평가: 신경 통합 기능 확인

Shh 처리된 내이 오가노이드와 나선신경절 세포(spiral ganglion neuron, SGN)를 공동 배양하여 어셈블로이드(assembloid)를 형성하고, 마이크로전극 어레이(MEA) 플랫폼을 이용해 전기생리학적 특성을 평가하였다. 명시야(brightfield) 이미징에서는 공동 배양 10일 후 오가노이드와 SGN 사이에 직접적인 세포 접촉이 확인되어 시냅스 통합의 가능성을 시사하였다.

MEA 기록 결과, 어셈블로이드의 자발적 전기 활성은 57.9 µV로, 오가노이드 단독(22.1 µV)이나 SGN 단독(17.5 µV) 배양보다 현저히 높았으며, 실제 달팽이관 절편(66.5 µV)에 근접하였다. 이는 Shh 처리 오가노이드 유래 유모세포와 SGN 사이에 기능적 신경 통합이 이루어졌음을 전기생리학적으로 뒷받침한다.

면역형광 염색에서는 전시냅스 리본 마커 CtBP2(적색)와 신경 돌기 마커 NF-H(자주색)가 공존하는 시냅스 접촉 지점이 확인되었다. 투과전자현미경(TEM) 분석에서도 세포막 인접 부위에 전시냅스 리본 유사 구조가 관찰되었으며, 시냅스 전·후 마커(CtBP2, PSD95)의 공동 발현 및 정량 분석을 통해 어셈블로이드 내 시냅스 형성이 실질적으로 증가하였음이 확인되었다.

종합 결론 및 임상적 의의

이번 연구는 Shh 신호 경로 활성화와 Wnt 억제를 병행하는 전략을 통해, 동종 Lgr5 양성 전구세포 유래 내이 오가노이드에서 기능적 유모세포와 성숙한 섬모 구조의 형성이 가능함을 처음으로 통합적으로 입증하였다. 핵심 발견은 기저판의 주요 구성 단백질(Pls1, LMO7, LRBA)의 발현 증가이며, 이는 섬모 구조 안정성 확보에 직결된다.

전자현미경, bulk RNA-seq, 단일세포 RNA-seq, 전기생리학적 평가를 아우르는 다층적 분석이 동일한 결론을 지지하였다는 점에서, 본 연구 결과의 신뢰도는 높다. 특히 오가노이드와 나선신경절 세포의 공동 배양 어셈블로이드에서 기능적 기계전기변환과 시냅스 연결이 확인된 것은, Shh 처리 내이 오가노이드가 단순한 세포 모델을 넘어 달팽이관 기능의 핵심 요소를 재현할 수 있음을 보여주는 중요한 증거이다.

향후 연구에서는 더 장기적인 배양 프로토콜을 통해 유모세포의 성숙도를 높이고, 달팽이관형 대 전정형 유모세포의 정체성을 보다 명확히 구분하는 작업이 필요하다. 생체 내(in vivo) 이식 모델에서의 통합 가능성을 검증하는 것 또한 임상 적용을 위한 필수 단계이다. 본 연구가 제시한 Shh-Wnt 병용 조절 플랫폼은 감각신경성 난청에 대한 세포 기반 치료 전략 개발의 새로운 출발점이 될 것으로 기대한다.

※ 본 연구는 'Theranostics' 2025년 15권 12호(pp. 5543–5565)에 게재되었습니다.