내이와 관련된 거의 모든 연구는 기능에 대한 관찰(청력 및 평형기능)을 하는데, 이 기능변화와 더불어 구조/구성변화에 대한 관찰이 매우 중요하고, 각각의 변화들이 연관성을 보일 때 비로소 관찰한 내용이 어느 정도 신뢰성을 갖출 수 있습니다. 구조변화는 gross structure에만 국한되지 않고, protein level의 변화까지 포함합니다. 예를 들어, 어떤 약물을 주입한 마우스의 청력이 deaf가 되었는데, 모든 달팽이관의 조직학적 검사 및 hair cell이 정상이고 spiral ganglion이 정상이라고 하면, 청력결과를 뒷받침 할 수 있는 데이터가 없는 상태가 됩니다. 물론 이때 deaf의 원인을 찾아가는 것이 또 중요한 연구가 되겠지만, 어떤 상황이든 구조/구성의 관찰은 필수적입니다. 이때 핵심적인 연구방법이 바로 imaging입니다.

(Figure 1. Immunofluorescence)

Immunofluorescence의 관찰방법

가장 흔히 접할 수 있는 imaging study는 immunofluorescence (IF)라고 하는 면역형광염색법입니다. 검출을 원하는 단백질에 형광이 붙은 항체를 반응시키거나, 항체를 반응시킨 후 secondary 형광항체를 붙여서 조직을 준비하게 되고, (Figure 1) 이것을 형광을 검출할 수 있는 microscope를 사용하여 촬영합니다. 대부분의 경우 confocal microscope을 사용하여 촬영을 하는데, confocal microscope는 초점거리를 자유롭게 움직여서 조직의 z-축에 해당하는 이미지를 최소한의 간섭으로 획득할 수 있는 장점이 있습니다. Confocal microscopy를 사용한 IF는 원하는 단백질만을 특이적으로 검출하고 비교분석 할 수 있다는 장점이 있고, 이미지의 quality가 매우 우수합니다. Figure 2와 같이 원하는 단백질의 발현을 따로따로 확인하고 이를 통합(merge)하여 다른 단백질을 동시에 발현하고 있는 세포들을 확인할 수 있습니다. 또한 Z-stack 기법을 이용하여 3차원으로 이미지를 구현할 수 있습니다.

(Figure 2. Confocal microscope을 이용한 염증세포의 관찰. DAPI는 세포핵을 나타내고, LysM은 중성구와 염증성단핵구 일부, F4/80은 macrophage(대식세포), Ly6G는 중성구를 나타낸다)

일반적으로 내이 조직을 Confocal microscopy로 관찰하기 위해서는 sample preparation 과정이 필수적입니다. 요약하면 1) 샘플채취, 2) 고정, 3) 탈석회(decalcification), 4) Section, 5) 염색, 6) mounting 입니다. 여기에서 4) section을 하느냐 마느냐는 관찰을 원하는 조직의 부위에 따라 결정합니다. 예를 들어 cochlea의 lateral wall이나 organ of Corti의 단면을 관찰하고자 한다면, mid-modiolus section을 합니다. Section을 보통 paraffinized sample을 사용하거나 frozen sample을 사용합니다. 검출을 원하는 단백질의 특성이나 구조의 특성을 고려하여 적절한 방법을 사용하게 됩니다.

하지만, 단면이 아니고 전체적인 구조를 관찰해야 하는 경우도 있습니다. 예를 들어 hair cell의 survival을 확인해야 한다던지, Stria Vascularis의 상태를 확인해야 하는 경우는 section된 샘플의 관찰은 대표성을 가질 수 없습니다. 이럴 경우 샘플 전체를 펴서 슬라이드에 mounting 하는 방법을 whole-mount 라고 합니다. 당연한 얘기지만 이 방법은 얇은 판형태를 가진 조직만 가능합니다. (아니면 판형태로 만들어야 합니다.) 왜냐하면 confocal microscopy에서 관찰하기 위해서는 slide glass 및 cover glass로 샘플을 덮어야 하기 때문입니다. 조직이 너무 두꺼운 경우, 염색이 불균질하게 되거나, 커버글라스 밑에 기포가 생기거나, 조직이 심하게 변형되는 불상사가 발생할 수 있습니다. 따라서 section보다 조금 더 연구자의 손기술이 필요한 방법입니다. Figure 2는 Cochlea lateral wall (spiral ligament)를 whole mount 하여 관찰한 결과입니다. 사진의 위쪽이 apex방향, 아래쪽이 base 방향입니다. 즉, spiral ligament의 중앙~하단부에 중성구/염증성 단핵구와 같은 면역세포들이 많이 유입된 상태로 해석할 수 있습니다.

또한 two-photon microscopy를 사용할 수 있습니다. 기본적인 원리는 confocal microscopy처럼 laser에 의해 발생하는 형광을 검출한다는 점에서 같습니다. 하지만, confocal은 여러가지 파장의 laser를 각각 쏘아서 각각 검출하고, two-photom microscopy는 한가지 파장의 laser를 두개 (two-photon) 사용하여 한 번에 형광을 검출한다는 점에서 다릅니다. 따라서 IF로 여러가지 단백질이 염색이 되어 있는 샘플을 confocal로는 각각의 laser를 발사하여 원하는 단백질만 발광하는 이미지를 얻을 수 있지만, two-photon microscopy는 한가지 파장의 laser만 사용가능하기 때문에 이미지의 specificity가 많이 떨어지고 한 번에 여러 형광들이 검출될 수밖에 없습니다. 즉 형광의 specificity가 많이 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, two-photon microscopy에는 confocal과는 비교할 수 없는 장점이 있습니다.

첫번째는 높은 조직 투과도입니다. Confocal의 경우 50 μm 이상 laser가 투과할 수 없기 때문에 그보다 두꺼운 조직은 관찰이 불가능합니다. Two-photon의 경우 파장이 긴 laser를 두개사용하기 때문에 laser의 조직투과도가 높습니다. 조직에 따라 다르지만 충분히 투명한 경우 500 μm 이상의 두께까지 관찰이 가능합니다. 두번째는 낮은 조직손상입니다. 파장이 낮은 laser이기 때문에 조직에서 발생하는 열이 confocal에 의해 매우 적어서 샘플의 손상이 드뭅니다. 세번째는 Second harmonic generation와 autofluorescence입니다. Two-photon laser의 중요한 특징은 collagen 등의 특정 패턴이 있는 단백질의 경우 면역염색 없이도 특정 주파수를 가진 형광을 발생시킬 수 있다는 점입니다. 이 세가지 장점을 조합해 보았을 때, 가장 이상적인 사용처는 live imaging입니다. 다만 내이연구에서는 내이의 해부학적 구조와 골조직에 의한 투과도의 한계로 제한적으로 사용되고 있습니다. (Figure 3)

(Figure 3. Two-photon 을 이용한 live imaging으로 촬용한 spiral ligament vessel (Red) 과 혈관내부의 중성구 (Green). Blue color는 골조직이 함유하고 있는 collagen에 의한 second harmonic generation이다. LPS를 중이내 주사하여 중이염을 유발 시킨 후 1일차에 mouse의 cochlea를 노출시킨 후 골조직을 그대로 투과하여 촬영하였음)

(Figure 4. Whole mount sample을 two-photon을 이용해 촬영한 사진. Autofluorescence로 3줄의 outer hair cells (OHC)가 확인되고 소음노출로 인해 degeneration된 부분 (*표)이 보인다.)

결론

Imaging은 내이 기초연구의 필수적인 방법이므로, 반드시 숙지하여야 하고 적절한 방법을 사용하기 위해서는 많은 경험이 필요합니다.