대한이비인후과학회 웹진 144호

알레르기비염과 부비동염 마우스 모델 0 한림대학교 강남성심병원 박상철

연세대학교 강남세브란스병원 이비인후과 조교수 - 배성훈

안녕하세요. 저는 한림대 강남성심병원에서 비과 진료를 담당하고 있는 박상철입니다. 질환의 병태생리에 대한 이해와 면역학적인 기전 실험, 치료제에 대한 효과 검증 등에 다양한 동물 모델이 활용되고 있습니다. 동물 모델 중에서는 마우스가 가장 널리 이용되고 있는데, 유전적인 정보가 잘 밝혀져 있어서 형질전환(transgenic), 유사유전자(congenic), 특정 유전자가 결핍된(knockout) 마우스를 얻기가 용이할 뿐만 아니라 많은 근교 계통(inbred strain)을 사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 마우스는 구입 및 사육 비용이 저렴한 편이며, 번식이 쉽고 면역학적 실험 방법이 잘 확립되어 있고, 시약의 투여가 다른 동물에 비교적 쉽습니다. 마우스 외에도 사람과 부비동 구조가 비슷한 토끼 모델 연구도 있으나, 지면 관계상 이번 웹진에서는 알레르기비염과 부비동염을 반영하는 마우스 모델의 제작방법과 활용에 대한 소개를 드리고자 합니다.

1. 질환 모델의 항원: 마우스에게 알레르기비염이나 부비동염을 유도하려면 항원을 반복적으로 투여하게 됩니다. 고전적으로 달걀에서 유래한 난알부민(ovalbumin, OVA)이 널리 사용되었는데, 저렴하고 순도가 높아서 질환이 잘 유도되며, OVA 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 형질전환 마우스(OT-I 와 OT-II 마우스)를 실험에 사용할 수 있는 등 면역학적인 기전 분석에 도움이 되기 때문입니다. 하지만 OVA를 단독으로 투여할 때는 Th2 면역반응이 아닌 면역관용(immune tolerance)이 생겨서 면역증강제(adjuvant)를 같이 투여해줘야 하며, OVA는 인간에서 호흡기 알레르기 질환을 일으키는 항원이 아니라는 한계점이 있습니다.
면역증강제로는 aluminum hydroxide (alum), lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor (TNF)등이 있으며 alum이 가장 흔히 사용됩니다. OVA를 고용량의 LPS와 같이 투여시에는 Th1 반응, OVA를 저용량의 LPS와 같이 투여시에는 Th2에 가까운 면역반응이 유도되는 것으로 알려져 있습니다. 최근에는 실제 사람에서 알레르기 질환을 유발하는 집먼지진드기(house dust mite, HDM), 곰팡이(Aspergillus fumigatus or Alternaria alternata), 바퀴벌레(Bla g2), 꽃가루(ragweed) 등 항원의 추출물 혹은 정제된 단백질을 단독 혹은 혼합한 마우스 모델이 널리 사용되고 있습니다.

2. 알레르기비염 마우스 모델 프로토콜

알레르기비염 마우스 모델을 제작하는 방법은 프로토콜은 연구자에 따라 매우 다양하나, 일반적으로는 항원을 감작(sensitization) 시킨 후에 항원을 유발(provocation)하는 과정을 거쳐 완성됩니다.
첫번째 단계인 항원을 감작시키는 과정은 전신적인 면역반응을 유도하기 위해 필요합니다. 고전적으로 복강을 통해 투여하는(intraperitoneal, i.p.) 방법이 가장 많이 사용되고 있는데, 주로 OVA나 HDM과 같은 항원을 alum과 같은 면역증강제와 같이 투여하며, 횟수는 1회에서 3회까지 다양하나, 감작과 감작 사이의 간격은 1주일이나 2주일 정도의 간격을 두는 것이 일반적입니다.
두번째 단계인 항원을 유발시키는 과정은 코에 국소적으로 염증 반응을 유도하기 위해 비강 내로(intranasal, i.n.) 항원을 투여하게 됩니다. 보통 항원 감작을 시행한 마지막 날로부터 1주일 정도 후에 시행하며, 항원 유발의 횟수는 3회에서 7회까지, 날마다 연속해서 시행하는 것이 일반적입니다. 비강내로 점적시 폐로 항원이 흡인되지 않도록 마취를 하지 않은 상태에서 진행합니다. 참고로 마취를 시행하면 폐로 항원이 쉽게 흡인되어 기관지 천식을 유도할 수 있습니다. 항원을 투여할 때는 마우스의 목과 등을 손가락으로 잡아서 움직이지 않게 한 후에 파이펫을 통해 마우스의 양쪽 콧구멍 입구에 번갈아 가면서 점적하는데, 삼키거나 폐로 흡인되지 않게 주의해야 합니다. 마우스가 자연스럽게 숨을 들이마시면서 항원을 잘 흡입하는지 관찰하면서 투여하는 것이 중요합니다. 과다하게 많은 항원을 단시간에 투여할 경우 흡인의 위험성이 있으며, 마우스의 목 주위를 너무 세게 잡을 경우 질식할 위험이 있습니다(그림 1).

유소아와 성인의 이관 비교 그림 그림 1. 마우스 비강내로 항원을 점적하는 모습
(adpated from Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg. 2022; 65(6): 309-318.)¹⁾

이와 같은 항원 투여 과정이 끝나면 보통 마지막 항원 투여 후 24시간 이내에 부검을 하여 분석을 합니다. 이는 시간이 경과함에 따라 기도 염증의 표현형과 조직에서의 면역반응이 회복되어 버리기 때문입니다. 예를 들면, 천식 마우스 모델의 경우 마지막 항원 유발 후 2주가 지나면 기도저항성과 기도 점액질 발현 및 기관지폐포세척액에서 염증세포 침윤 정도가 대조군과 차이가 없을 정도로 회복되는 것으로 알려져 있습니다.

제가 OVA 및 HDM을 사용하여 알레르기비염 마우스 모델을 만드는 프로토콜을 정리하였습니다(그림 2). 암컷 4~6주령의 마우스를 주로 사용하며, OVA 혹은 HDM을 alum과 함께 복강내로 투여하는 감작과정을 2~3회 거친 후에 항원을 비강내로 5~6회 투여하는 유발 과정을 거칩니다.

유소아와 성인의 이관 비교 그림 그림 2. OVA(A) 혹은 HDM(B)을 사용한 알레르기비염 마우스 모델 프로토콜
(adpated from Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg. 2022; 65(6): 309-318.)¹⁾

3. 부비동염 마우스 모델

만성 부비동염 마우스 모델 역시 OVA, HDM, 곰팡이, Staphyloccal enterotoxin B (SEB), protease from S. aureus 등의 항원을 사용합니다. 일반적으로 비염 마우스 모델보다는 장기간(8-12주 이상) 항원을 투여해야 부비동염 모델이 제작되며, 투여하는 항원에 따라서 호산구성 부비동염 혹은 비호산구성 부비동염이 만들어집니다. 기존에 발표되었던 여러 프로토콜을 표로 정리하였습니다.

마우스 종, 성별, 주령	사용한 항원 종류	항원 투여 기간	생성된 부비동염 및 reference
C57BL/6J 8-10주령	i.p. OVA 2μg + i.n. 3% OVA	12주	allergic chronic rhinosinusitis²⁾
C57BL/6J 8-10주령	S.pneumoniae, merocel packing	12주	bacterial chronic rhinosinusitis²⁾
Balb/c 5주령	i.p. OVA 25μg + i.n. (3% OVA + SEB 5ng)	103일	allergic chronic rhinosinusitis³⁾
C57BL/6J 8-10주령	i.d. HDM 100μg + i.n. (HDM 20μg + SEB 10ng)	103일	allergic chronic rhinosinusitis⁴⁾
C57BL/6 male 4주령	i.n. OVA 75μg + protease from Aspergillus oryzae 2U	12주	eosinophilic chronic rhinosinusitis⁵⁾
C57BL/6N female 6주령	i.n. (HDM 20μg + Aspergillus fumigatus 20μg, Alternaria alternata 20μg + protease from S. aureus 1μg)	12-16주	eosinophilic chronic rhinosinusitis⁶⁾
Balb/c female 5주령	i.p. OVA 75μg + i.n. Alternaria alternata 50μg	8-16주	allergic chronic rhinosinusitis⁷⁾
Balb/c female 5주령	i.p. PBS + i.n. Alternaria alternata 50μg	8-16주	non-allergic chronic rhinosinusitis⁷⁾
C57BL/6 male 8주령	topically MC903 (calcipotriol) 2nmol with OVA 100μg + i.n. OVA 2400μg	19일	eosinophilic chronic rhinosinusitis⁸⁾

4. 마우스 선택시 고려 사항: 마우스의 종과 성별에 따라서 질병의 감수성이 다르게 나타나므로 고려해야 합니다. C57BL/6 종과 BALB/c 종을 실험에서 많이 사용하게 되는데 BALB/c 종이 알레르기의 표현형 및 Th2 면역 반응이 더 잘 나타나는 것으로 알려져 있습니다. 최근 HDM (Der f1) 항원을 이용한 알레르기비염 모델 국내 보고에서도 호산구와 호중구의 침윤 정도에는 두 종간의 유의한 차이가 없었으나, 혈청 총 IgE와 Der f1 특이 IgE, IgG1, IgG2의 발현과 IL-4, eotaxin-1, eotaxin-2, CXCCL-1, CXCCL-2의 발현이 BALB/c에서 C57BL/6보다 더 증가하였습니다.⁹⁾ 관찰을 하고자 하는 형질전환 혹은 특정 유전자가 결핍된 마우스의 유전적 배경에 따라 C57BL/6N 혹은 C57BL/6J 종도 사용되고 있습니다.
또한, 일반적으로 암컷이 수컷보다 더 알레르기 염증 반응이 더 잘 일어나는 것으로 알려져 있습니다. BALB/c 마우스 실험에서 암컷의 폐, 기관지에서 2형 면역반응이 더 심하게 나타났으며 사이토카인 및 케모카인의 생성, 호산구의 활성화 및 2형 선천성 림프구세포(group 2 innate lymphoid cells, ILC2s)의 발현이 더 증가함이 확인되었습니다.¹⁰⁾ C57BL/6 마우스 실험에서도 암컷에서 수컷보다 기도저항성이 더 증가하였고, 대식세포(macrophage)에서 IL-5와 IL-1β의 발현이 더 증가하며 대체 활성화된 2형 대식세포의 아형인 M2a와 연관된 유전자의 발현이 증가하는 것이 보고되었습니다.¹¹⁾

5. 알레르기비염 및 부비동염 마우스 모델의 지표

먼저, 비강내 염증세포 침윤 정도를 조직병리 사진으로 관찰합니다. 마우스의 머리 부분을 채취하여 절단한 후 파라핀 블록으로 제작하여 슬라이드 제작을 통해 코의 비중격 및 비강벽을 따라 호흡상피를 관찰할 수 있습니다. Hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통해 조직의 전체적인 염증세포 침윤 정도를 확인하고 periodic acid-Schiff (PAS) 염색을 통해 배상세포의 과증식 정도를 확인하며, Sirius red 염색을 통해 호산구 침윤을 관찰하고, Masson’s trichrome 염색으로 상피세포 층의 두께와 콜라젠 침윤 정도를 확인할 수 있습니다. 또한 단백질에 붙는 특이 항체를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 면역형광(Immunofluorescence) 염색을 하면 조직에 특이하게 나타나는 단백질을 세밀하게 분석할 수 있습니다. 관찰한 조직은 각 절단면에서 무작위로 여러 곳을 선정하여 고배율(high power field)당 보고자 하는 세포의 개수의 합을 결과로 제시하거나, 염증세포의 분포 정도를 정량화된 scoring 방법이나 ImageJ와 같은 소프트웨어를 통한 면적 계산방법을 통해 확인할 수 있습니다. 제가 관찰했던 대표적인 조직 사진을 그림 3에 정리하였습니다.

유소아와 성인의 이관 비교 그림 그림 3. 알레르기비염 및 호산구성 부비동염 마우스 모델의 비강 점막 조직 사진.
(위) Hematoxylin and eosin (H&E)-stain
(중간) Periodic acid-Schiff (PAS)-stain
(아래) Sirius red-stain (original magnification: ×400, scale bar: 50 μm).

혈청에서 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)을 측정하는 것도 유용한데, total IgE 및 OVA나 HDM과 같은 항원에 특이적인 IgE 및 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 등을 확인합니다. 혈청은 마우스의 안와 혹은 심장에서 채혈을 하여 얻게 되며 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 통해 Ig의 발현 정도를 확인할 수 있습니다. 또한, 사이토카인의 발현 정도를 ELISA 혹은 polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 측정하며, 면역세포의 수와 발현 정도 및 전사인자(transcription factor), 세포내 사이토카인의 발현을 유세포분석(flow cytometry)을 통해 측정합니다. 이는 코 점막과 코세척액(nasal lavage fluid, NALF) 혹은 경부 림프절을 채취하여 결과를 확인할 수 있습니다. 코세척액은 카테터를 인두 개구부위로 삽입하여 콧구멍으로 나오게 하여 phosphate-buffered saline (PBS)을 주입하여 흘러나오는 용액을 모아서 얻을 수 있습니다(그림 4).

유소아와 성인의 이관 비교 그림 그림 4. 코세척액을 얻는 모습
(adpated from Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg. 2022; 65(6): 309-318.) ¹⁾

알레르기비염 마우스의 경우 재채기와 코를 비비는 정도를 측정하기도 하는데 일반적으로 2명 이상의 관찰자가 마지막 항원 투여를 한 후 20분 정도 관찰하여 재채기와 코를 비비는 횟수를 합하여 결과로 기록하는데 주관적인 지표 이기 때문에 해석에 주의가 필요합니다.

6. 결론: 마우스 모델 실험 결과를 사람의 질환에 똑같이 적용하기에는 무리가 있습니다. 해부학적으로 사람은 비강 대부분이 호흡상피로 덮여있는 반면에 마우스는 비강의 거의 절반을 후각상피가 차지하며, 비강의 전방에는 호흡상피, 후방에는 후각상피가 분포합니다. 또한 마우스 모델에서는 침윤된 호산구의 탈과립 및 상피세포내 축적 현상이 나타나지 않으며, 알레르기비염이나 천식은 사람에서만 일어나는 질환으로 마우스에서는 자연적으로 발생하지 않기에 인위적으로 항원을 투여하여 유발을 시키다보니 기도의 염증이 사람에서처럼 오래 지속되지 않는 한계가 있습니다. 하지만 사람 대상 연구의 한계점을 뒷받침해줄 수 있는 유용한 방법으로 적절히 활용된다면, 알레르기비염과 부비동염의 병태생리에 대한 이해와 면역학적인 기전 실험, 치료제에 대한 효과 검증 등에 도움이 될 것 입니다. 마지막으로 본 원고의 내용은 제가 2022년에 출판한 한이인지 논문¹⁾을 기반으로 작성 되었음을 밝힙니다.

7. 참고문헌

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